Staphylococcus aureus ist einer der am meisten gefürchteten opportunistischen nosokomialen humanen Pathogene und für viele lebensbedrohliche Erkrankungen wie Meningitis, Lungenentzündung, Osteomyelitis, Endokarditis, septische Arthritis, toxisches Schocksyndrom und Septikämie verantwortlich (Archer, 1998 ▶ ). Die Resistenz dieses Organismus gegen Antibiotika wie Methicillin und Vancomycin hat seine bereits wachsende Bedrohung weiter erhöht.
Der glykolytische Weg, der der primäre ATP-Syntheseweg der Zelle ist, ist einer der wichtigsten Wege für das Überleben der Mikrobe. Als überwiegende Hersteller von ATP dienen die Enzyme des glykolytischen Signalwegs daher als potenzielle Angriffspunkte für das Wirkstoffdesign gegen diesen Signalweg. Das Enzym Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH) ist das sechste Enzym des glykolytischen Weges. Es wirkt auf Glyceraldehyd-3-phosphat (G3P), wandelt es in 1,3-Bisphosphoglycerat (1,3-BPG) um, verbraucht anorganisches Phosphat und nutzt die Energie für Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (reduziert) (NADH). Der Reaktionsmechanismus wurde intensiv untersucht, insbesondere für bakterielle und eukaryotische GAPDHs (Segal & Boyer, 1953, Trentham, 1971, Harris & Waters, 1976, Soukri et al. , 1989, Michels et al. , 1996 ) Boschi-Muller & Branlant, 1999, Moras et al. , 1975, und besteht aus zwei Schritten: einer Oxidoreduktionsreaktion, gefolgt von einer Phosphorylierung des Thioesters. Erstens erfährt die Aldehydgruppe von G3P einen nucleophilen Angriff durch das katalytische Cystein, um ein Thiohämiacetal-Zwischenprodukt zu bilden. Der zweite Schritt beinhaltet die Phosphorylierung des resultierenden Thioesters durch nucleophilen Angriff von anorganischem Phosphat an der Carbonylgruppe des Thioacylenzyms. Dem zweiten Schritt geht der Austausch von NADH gegen NAD voraus, wobei letzterer den Phospholyseschritt begünstigt. NAD als Cofaktor ist nicht nur für die Funktionalität des Enzyms entscheidend, sondern spielt auch eine wichtige strukturelle Rolle. Die Rolle der Coenzym-Bindung bei kooperativen Wechselwirkungen bei der tetramerischen Phosphorylierung von GAPDHs war Gegenstand aktiver Forschung. In Abhängigkeit von der Quelle des Enzyms wurde gezeigt, dass die Bindung von NAD an GAPDH entweder positive oder negative Kooperativität aufweist (Roitel et al. , 1999).
Obwohl die Rolle von GAPDH als Haushaltsenzym gut untersucht wurde, haben kürzlich durchgeführte Untersuchungen neue Eigenschaften dieses Enzyms gezeigt. Dazu gehören die Lokalisierung auf der Zelloberfläche, die Bindung an zelluläre Moleküle (Pancholi & Fischetti, 1992; Gil-Navarro et al. , 1997; Delgado et al. , 2001 ) ; Gozalbo et al. , 1998; Zang et al. 1998, Modun & Williams 1999, Taylor & Heinrichs 2002 und Rollen in der Apoptose (Sirover 1999).
Obwohl die Rolle von GAPDH als Haushaltsenzym gut untersucht wurde, haben kürzlich durchgeführte Untersuchungen neue Eigenschaften dieses Enzyms gezeigt. Dazu gehören die Lokalisierung auf der Zelloberfläche, die Bindung an zelluläre Moleküle (Pancholi & Fischetti, 1992; Gil-Navarro et al. , 1997; Delgado et al. , 2001 ) ; Gozalbo et al. , 1998; Zang et al. 1998, Modun & Williams 1999, Taylor & Heinrichs 2002 und Rollen in der Apoptose (Sirover 1999).
Der notorische Methicillin-resistente Stamm von Staphylococcus aureus (MRSA252) enthält zwei zytosolische GAPDHs: GAP1 (NCBI-Zugangscode YP_040254 ) und GAP2 (NCBI-Zugangscode YP_041153 ). Wir haben bereits über die Klonierung, Überexpression, Reinigung, Kristallisation und vorläufige röntgenkristallographische Analysen von an NAD gebundenem GAP1 berichtet (Mukherjee et al. , 2008). Die Struktur wurde durch molekularen Ersatz gelöst und Strukturanalysen zeigten, dass der Cofaktor in weitem Maße an die klassische Rossmann-Falte und an einen Teil der großen S-förmigen Schleife bindet, die für die Aufrechterhaltung der Intersubunit-Kontakte verantwortlich ist (S. Mukherjee, D. Dutta, B. Saha & AK Das, unveröffentlichte Arbeit). Es wird erwartet, dass es einen signifikanten strukturellen Unterschied zwischen der Apo-Form (ohne NAD) und der Holo-Form (NAD-gebunden) des Enzyms gibt. Ein Vergleich zwischen diesen beiden Formen zeigt interessante Konformationsänderungen auf, die durch den Cofaktor hervorgerufen werden, die funktionell mit dem Katalyse-Mechanismus korreliert werden können und daher untersucht werden müssen. Daher zielt die vorliegende Studie auf die Reinigung, Kristallisation und vorläufige Röntgenbeugungsanalyse von GAP1 aus MRSA252 in der Apo-Form ab.