Abstrakt
Staphylococcus aureus ist ein wichtiger nosokomialer und in der Gemeinschaft erworbener Erreger. Seine genetische Plastizität hat die Entwicklung vieler virulenter und arzneimittelresistenter Stämme erleichtert und stellt eine große und sich ständig ändernde klinische Herausforderung dar. Wir sequenzierten die 2,8-Mbp-Genome von zwei krankheitsverursachenden S. aureus- Stämmen, die aus verschiedenen klinischen Situationen isoliert wurden: einem kürzlich im Krankenhaus erworbenen Vertreter des epidemischen Methicillin-resistenten S. aureus- EMRSA-16-Klons (MRSA252), einem klinisch wichtigen und global verbreitete Abstammung; und ein Vertreter eines invasiven gemeindenahen Methicillin-empfänglichen S. aureus- Klons (MSSA476). Ein vergleichender genomischer Ansatz wurde verwendet, um die Mechanismen der Evolution klinisch wichtiger S. aureus- Genome zu untersuchen und Regionen zu identifizieren, die die Virulenz und Arzneimittelresistenz beeinflussen. Die Genomsequenzen von MRSA252 und MSSA476 haben eine gut konservierte Kernregion, unterscheiden sich jedoch deutlich in ihren akzessorischen genetischen Elementen. MRSA252 ist der bislang genetisch am vielfältigsten sequenzierte S. aureus- Stamm: ~ 6% des Genoms sind im Vergleich zu anderen veröffentlichten Genomen neu und enthalten mehrere einzigartige genetische Elemente. MSSA476 ist Methicillin-empfindlich, enthält jedoch ein neues Staphylococcus-Chromosomen-Kassetten-Mec-Element (SCC 476 ), das an derselben Stelle auf dem Chromosom wie SCC- Mec- Elemente in MRSA-Stämme integriert ist, jedoch eine mutmaßliche Fusidinsäure codiert Resistenzprotein. Die entscheidende Rolle, die akzessorische Elemente bei der raschen Entwicklung von S. aureus spielen, wird durch den Vergleich des MSSA476-Genoms mit dem eines äußerst nahe verwandten Stamms, der von der MRSA-Gemeinschaft erworben wurde, deutlich. Die unterschiedliche Verteilung großer mobiler Elemente, die Virulenz- und Arzneimittelresistenz-Determinanten tragen, kann für die klinisch wichtigen phänotypischen Unterschiede in diesen Stämmen verantwortlich sein.
Die Auswirkungen von Infektionen mit Staphylococcus aureus auf die menschliche Gesundheit in Gemeinden und Krankenhäusern haben in den letzten Jahren zu intensiven Untersuchungen dieses Organismus geführt. Es ist der Erreger einer Vielzahl von Krankheiten, von Karbunkeln und Lebensmittelvergiftungen über schwerwiegendere Geräte- und Wundinfektionen bis hin zu lebensbedrohlichen Zuständen wie Bakteriämie, nekrotisierender Pneumonie und Endokarditis. S. aureus produziert eine Vielzahl von Virulenzfaktoren, die das Anhaften, die Besiedlung, die Zell-Zell-Interaktion, die Immunhinterziehung und Gewebeschäden erleichtern. Die Anzahl der wirksamen Antibiotika wurde durch das Auftreten von Resistenzen gegen Penicillin, Methicillin und in jüngerer Zeit gegen Vancomycin ( 1 , 2 ) verringert, ein Problem, das durch das kürzliche Auftreten von Methicillin-resistenten S. aureus (MRSA) verstärkt wurde. Beförderung und Krankheit in der Gemeinde ( 3 , 4 ).
Die Genome von zwei kürzlich isolierten klinischen S. aureus- Stämmen wurden sequenziert: ein im Krankenhaus erworbener MRSA-Stamm (MRSA252), der für den äußerst erfolgreichen epidemischen EMRSA-16-Klon repräsentativ ist, und ein in der Gemeinschaft erworbener Methicillin-empfänglicher S. aureus- Stamm (MSSA) (MSSA476). Inzwischen sind für S. aureus vollständigere Genome verfügbar als für jede andere Bakterienart. Dies bietet einen detaillierten Einblick in die Evolutionsprozesse, die zu Stämmen mit unterschiedlichem Virulenz- und Arzneimittelresistenzpotential führen. In unseren Vergleichsanalysen wurden die zuvor veröffentlichten Genome eng verwandter, im Krankenhaus erworbener MRSA- und Vancomycin-intermediär anfälliger S. aureus- Stämme (N315 bzw. Mu50) ( 5 ) und eines in der Gemeinschaft erworbenen MRSA-Stamms (MW2) ( 6 ) verwendet. Darüber hinaus wurden umfangreiche MLST-Daten (Multilocus Sequence Typing) für diese Spezies erstellt, die den Vergleich der sequenzierten Stämme im Kontext der gesamten S. aureus- Population ermöglichen ( 7 ). MRSA252 gehört zu den klinisch wichtigen EMRSA-16-Klonen, die für die Hälfte aller MRSA-Infektionen in Großbritannien verantwortlich sind ( 8 ) und gehört zu den wichtigsten MRSA-Klonen in den USA (200) ( 9 ). Sein Auftreten in den letzten 10 Jahren war mit einem signifikanten Anstieg der Anzahl von S. aureus- Infektionen in britischen Krankenhäusern verbunden und wird in der Mehrzahl der britischen Krankenhäuser als endemisch angesehen ( 8 ). MSSA476 wurde ausgewählt, weil es bei einem immunkompetenten Kind in der Gemeinschaft eine schwere invasive Krankheit hervorrief und zu einem Hauptklon gehörte, der mit einer in der Gemeinschaft erworbenen Krankheit assoziiert ist, die auch den in der Gemeinschaft erworbenen MRSA-Stamm MW2 enthält ( 10 ).
In dieser Studie beschreiben wir allgemeine Merkmale der beiden neuen Genome und heben die Bedeutung mobiler genetischer Elemente für den Erwerb von Merkmalen von klinischer Bedeutung hervor. Wir präsentieren auch Vergleiche von sehr ähnlichen und sehr unterschiedlichen Genomen, die die Muster der genomischen Diversifikation über die Zeit aufdecken und insbesondere die Geschwindigkeit veranschaulichen, mit der sich Resistenzgene und mutmaßliche Virulenzgene durch lateralen Gentransfer zwischen Stämmen bewegen.
Methoden
Bakterienstämme. Im Krankenhaus erworbener epidemischer Stamm MRSA252 . MRSA252 wurde 1997 aus einer 64-jährigen Frau isoliert, die postoperativ MRSA erworben hatte. Der Organismus war Teil eines Miniaturausbruchs in einer Intensivstation, bei dem alle drei infizierten Patienten als direkte Folge einer MRSA-Septikämie (septischer Schock oder Multiorganversagen nach septischem Schock) starben.
MRSA252 ist resistent gegen Penicillin, Ciprofloxacin, Erythromycin und Methicillin und empfindlich gegen Fusidinsäure, Rifampicin, Tetracyclin, Trimethoprim, Gentamicin und Amikacin. Der Stamm wurde durch Pulsfeld-Gelelektrophorese als zum EMRSA-16-Klon gehörend und durch MLST ( 8 , 10 ) als zum Sequenztyp (ST) 36 gehörend typisiert.
In der Gemeinschaft erworbener invasiver Stamm MSSA476 . MSSA476 wurde 1998 aus einem 9-jährigen Jungen mit ambulant erworbener primärer Osteomyelitis der oberen Tibia und Bakteriämie isoliert, der keine prädispositionierenden Risikofaktoren aufwies.
Obwohl der Stamm gegen Penicillin und Fusidinsäure resistent war, war er anfällig für die am häufigsten verwendeten Antibiotika, einschließlich Ciprofloxacin, Rifampicin, Tetracyclin, Trimethoprim, Erythromycin, Gentamicin, Amikacin und Methicillin. Nach dem chirurgischen Eingriff und der Behandlung mit iv Flucloxacillin erholte sich der Patient vollständig. Der Stamm wurde von MLST ( 10 ) zu ST1 zugeordnet.
Gesamtgenomsequenzierung. Die beiden Genomsequenzen wurden unabhängig voneinander von getrennten Teams innerhalb der Pathogen Sequencing Unit des Sanger Institute hergestellt, um sicherzustellen, dass keine Kreuzkontamination zwischen den beiden Projekten bestand. Die Sequenz wurde zusammengesetzt, fertiggestellt und mit Anmerkungen versehen, wie in Lit. 1 beschrieben. 11 durch Verwendung von Artemis zum Sammeln von Daten und zur Erleichterung der Annotation ( 12 ); Detaillierte Informationen finden Sie in Supporting Methods , das auf der PNAS-Website veröffentlicht wird.
Vergleichende Genomik. Der Vergleich der Genomsequenzen wurde mithilfe des Artemis- Vergleichstools (KR, unveröffentlichte Daten; siehe auch
https://web.archive.org/web/20090725021310/http://www.sanger.ac.uk/Software/ACT/ ) erleichtert , das die Visualisierung von Blastn- und Tblastx- Vergleichen zwischen den Genomen ermöglichte ( 13 ). Orthologe Proteine wurden unter Verwendung von Fasta mit anschließender manueller Kuration als wechselseitig beste Übereinstimmungen identifiziert. Die für Vergleiche verwendeten Genome waren für die S. aureus- Stämme Mu50 ( 5 ), N315 ( 5 ) und MW2 ( 6 ).
Ergebnisse
Merkmale der Genome MRSA252 und MSSA476. Die MRSA252- und MSSA476-Chromosomen sind 2.902.619 bp und 2.799.802 bp groß und enthalten 2.671 bzw. 2.565 vorhergesagte proteinkodierende Sequenzen (CDS) bzw. Gene. Eine Zusammenfassung der allgemeinen Eigenschaften der beiden Genome finden Sie in den Hintergrundinformationen . Vergleiche der Chromosomen zeigen, dass sie miteinander und mit denen der sequenzierten S. aureus- Stämme N315, Mu50 und MW2 kollinear sind ( 5 , 6 ). Das konservierte „Kern“ -Genom ist jedoch mit Regionen mit kleinen und großen Unterschieden übersät ( Abb. 1 ).
Eine Variation im kleinen Maßstab, definiert als genetische Veränderungen, die ein einzelnes Gen oder eine kleine Anzahl von Genen (<10 CDS) betreffen, umfasst die Bildung von Pseudogenen durch Integration der Insertionssequenz, Punktmutationen und Variation der polymeren Nukleotidwiederholungen. Details der Insertionssequenzelemente und Pseudogene für beide Stämme sind in den Tabellen 2 und 3 angegeben, die als unterstützende Information auf der PNAS-Website veröffentlicht sind. Eine großräumige Variation (mit> 10 CDS) ist mit horizontal erworbener DNA verbunden, häufig an Orten, die zuvor als mobile genetische Elemente oder „genomische Inseln“ identifiziert wurden ( Abb. 1 ) ( 5 , 6 ). Viele der in diesen Regionen enthaltenen Gene sind mit Virulenz oder Arzneimittelresistenz assoziiert. Eine Zusammenfassung der genomischen Inseln von MRSA252 und MSSA476 und der wichtigen Determinanten, die sie tragen, ist in Tabelle 1 angegeben .
Genetische Elemente, die Resistenzgene in MRSA252 und MSSA476 tragen. MSSA476 ist resistent gegen Penicillin und Fusidinsäure, aber anfällig für Methicillin. Überraschenderweise enthält MSSA476 ein neues staphylokokken-chromosomales Kassetten- (SCC-) mec- ähnliches Element (bezeichnet als SCC 476 ), das an derselben Stelle auf dem Chromosom wie SCC- mec- Elemente in MRSA-Stämmen integriert ist ( 1 ). Der 22,8-kb-SCC 476 enthält 18 CDSs und teilt die gleichen linken und rechten Grenzen ( attL bzw. attR ) und ähnliche invertierte Wiederholungssequenzen wie SCC- mec- Elemente ( Fig. 2 ) ( 14 ). Im Gegensatz zu SCC- mec- Elementen trägt SCC 476 jedoch nicht das mecA- Gen (das für Penicillin-bindendes Protein 2a kodiert), das Resistenz gegen Methicillin verleiht, sondern ein CDS (SAS0043), das für ein Protein ähnlich (43,7% Aminosäureidentität) wie das Plasmid-getragene Fusidinsäure-Resistenz-Determinante Far1 ( 15 ). Das einzige andere scheinbare Resistenzprotein, das im MSSA476-Genom enthalten ist, ist die pSAS1-Plasmid-kodierte β-Lactamase (pSAS19). Dieser Befund korreliert gut mit dem Antibiotikaresistenzprofil von MSSA476.
Sechs CDS innerhalb von SCC 476 sind in Bezug auf andere Arten von SCC- mec- Elementen konserviert ( 2 ) ( 16 ), einschließlich der beiden ortsspezifischen Rekombinasen ccrA und ccrB , die denjenigen in SCC- mec- Elementen vom Typ I am ähnlichsten waren ( 17 ). Die größte Ähnlichkeit dieser Proteine bestand jedoch mit den ccrA- und ccrB- Homologen eines Staphylococcus hominis- Nicht- mec- SCC-Elements (SCC 12263 ) ( 18 ). Am linken Ende des SCC 476- Elements befinden sich drei CDS, die den Komponenten eines Einschränkungsmodifikationssystems vom Typ I ähnlich sind: hsdM, hsdS und hsdR .
Das im Krankenhaus erworbene MRSA252 ist resistent gegen eine größere Anzahl von Antibiotika als MSSA476; als folge enthält es mehr von mobilen Elementen kodierte Resistenzdeterminanten als der von der Community erworbene Stamm. Das Genom enthält ein 58,8-kb-SCC- mec- Element an einer Stelle nahe dem Replikationsursprung ( 1 ). Die Struktur des SCC- mec- Elements in MRSA252 entspricht der eines SCC- mec- Elements vom Typ II ( Abb. 2 ) und ist den in den N315- und Mu50-Genomen berichteten sehr ähnlich ( 14 , 17 ).
Das SCC- mec- Element trägt eine integrierte Kopie von pUB110 mit Bleomycin- und Kanamycin-Resistenzgenen und eine Kopie von Tn 554 mit Erythromycin- und Spectinomycin-Resistenzgenen. Das rechte Ende des SCC- mec- Elements MRSA252 enthält sechs bisher nicht charakterisierte CDS (drei hypothetische Proteine und drei Transposasen) und einen Genrest. Unmittelbar stromabwärts des SCC- mec- Elements befindet sich eine 15,6-kb-Region, die hypothetische Proteine, Proteine mit Ähnlichkeit zu Modifikations- und Spezifitätskomponenten eines mutmaßlichen Restriktionsenzymsystems vom Typ IV, eine Reihe von Proteinen mit verschiedenen vorhergesagten Funktionen (SAR0087-SAR0103) codiert. Zusätzlich zum SCC- mec- Element gibt es zwei Kopien eines Tn 554- Transposons, das Erythromycin-Resistenz trägt; eine befindet sich im SCC- mec- Element vom Typ II ( Fig. 2 ) und die andere Kopie wird in ein Homolog des DNA-Reparaturgens radC (SAR1733 und SAR1740) inseriert. Das MRSA252-Chromosom enthält auch ein Tn 552- Transposon, das die BlaI-, BlaR- und BlaZ-Komponenten der induzierbaren S. aureus- β-Lactamase codiert. In das Chromosom ist auch ein Element integriert, das Ähnlichkeit mit dem Transposon Tn 916 aufweist ( Abb. 1 ). es scheint jedoch keine offensichtlichen Resistenzdeterminanten zu tragen.
Ein integriertes Plasmid verleiht Resistenz gegen die Schwermetalle Arsen und Cadmium ( Tabelle 1 ). MSSA476 trägt auch eine Resistenz gegen Schwermetalle auf einem freien Plasmid, pSAS1.
Im Unterschied zu den charakterisierten Arzneimittelresistenz-Determinanten, die mit mobilen genetischen Elementen in MRSA252 assoziiert sind, gibt es mehrere chromosomal codierte Determinanten, einschließlich eines Fluorchinolon-Resistenz-Proteins ( norA ), SAR0748; ein mutmaßliches Fosfomycin-Resistenzprotein ( fosB ), SAR2419; und mit Teicoplaninresistenz assoziierte Membranproteine ( tcaAB ) (SAR2442 und SAR2441). Es gibt auch mehrere andere hypothetische Proteine mit Ähnlichkeit zu Proteinfamilien, die mit Arzneimittelresistenz assoziiert sind.
Genetische Elemente, die Virulenzgene in MRSA252 und MSSA476 tragen. S. aureus- Pathogenitätsinseln (SaPI) sind mobile genetische Elemente, die häufig Superantigen-Gene wie Toxin-Schock-Syndrom und Enterotoxine B und C tragen, die an toxischem Schock und Lebensmittelvergiftung beteiligt sind. MRSA252 trägt ein SaPI-ähnliches Element, SaPI4, das Homologe von Pathogenitätsinselproteinen enthält und Syntenie (konservierte Genreihenfolge) mit den zuvor charakterisierten Pathogenitätsinseln SaPI1, SaPIbov und „SaPI3“ aufweist ( 19 - 21 ). SaPI4 hat ein Integrasegen und eine Insertionsstelle stromabwärts des ribosomalen Proteingens rpsR , enthält jedoch mehrere hypothetische Proteine ohne Ähnlichkeit mit charakterisierten Virulenzgenen.
Die genomischen Inseln νSaα und νSaβ wurden in den Genomen aller bisher sequenzierten S. aureus- Stämme identifiziert ( 5 , 6 ). Die Inseln befinden sich an denselben Orten und enthalten Gene, die mit Pathogenität assoziiert sind. MRSA252 enthält Varianten dieser Inseln ( Abb. 1 und Tabelle 1 ), während die von MSSA476 mit denen von MW2 übereinstimmen ( 6 ).
Die Übertragung von Toxingen durch lysogene Bakteriophagen oder Phagenumwandlung ist ein wichtiger Mechanismus bei der Entwicklung virulenter Stämme. Die Genome MRSA252 und MSSA476 enthalten jeweils zwei Prophagen ( Abb. 1 und Tabelle 1 ). Von den vier Prophagen können drei in die zuvor beschriebenen Gruppen [φSa2 (252), φSa3 (252) und φSa3 (476)] ( 6 ) eingeteilt werden. Der vierte Prophage ist an einem Ort in MSSA476 integriert und wurde mit φSa4 [φSa4 (476)] bezeichnet. Dieser Prophage hat eine Mosaikstruktur, die Ähnlichkeitsbereiche mit φSa2 (252), φSa2 (MW2) ( 6 ) und φ12 ( 22 ) aufweist und keine bekannten Virulenzdeterminanten trägt. Die φSa4-Integrase ist am engsten mit der Integrase aus dem Phagen L54a ( 23 ) verwandt und in die Promotorregion der mutmaßlichen Serinprotease htrA integriert . φSa2 (252) ist ein 46-kb-Prophage und hat Ähnlichkeit mit φSa2 (MW2), φPVL und φSLT ( 6 , 24 , 25 ), enthält jedoch im Gegensatz zu diesen drei keine Panton-Valentine-Leukocidin-Toxin-Untereinheiten oder andere offensichtliche Virulenzdeterminanten. In allen sequenzierten S. aureus- Genomen wurde ein Phage der φSa3-Familie identifiziert, der jeweils in das hlb -Gen (β-Hämolysin) integriert ist. Diese Prophagen enthalten typischerweise gut charakterisierte Virulenzfaktoren wie Staphylokinase und pyrogene Toxin-Superantigen-Proteine. Die beiden Prophagen φSa3 (252) und φSa3 (476) enthalten die Gene Staphylokinase ( sak ) und Enterotoxin Typ A ( sea ).
Vielfalt der S. aureus- Stämme. MLST ist eine weit verbreitete Technik zur Typisierung klinischer S. aureus- Isolate und wurde verwendet, um zu zeigen, dass die Populationsstruktur von S. aureus stark klonal ist ( 7 ). Für eine Auswahl von S. aureus- Stämmen, einschließlich solcher, deren Genome sequenziert wurden, wurden die Sequenzen der sieben in MLST verwendeten Housekeeping-Genfragmente (Sequenzen wurden aus der S. aureus- MLST-Datenbank
Mlst.net bezogen ) wurden Ende-zu-Ende verbunden (verkettet) und ein Split-Dekompositionsgraph erstellt ( Abb. 3 ). Von den bisher sequenzierten Stämmen ist MRSA252 am phylogenetischsten verschieden (ST36; Fig. 3 ). MSSA476 ist andererseits viel enger verwandt mit den anderen sequenzierten Stämmen (die alle im Genotyp relativ eng verwandt sind; Fig. 3 ) und ist durch MLST von einem anderen sequenzierten, gemeinschaftlich erworbenen Stamm MW2 (beide ST1) nicht zu unterscheiden ( 6 ). Zwei andere veröffentlichte Genomstämme, N315 und Mu50 ( 5 ), weisen ebenfalls einen identischen MLST-Typ auf: ST5. Die verbleibenden zwei unveröffentlichten, aber sequenzierten Stämme, NCTC8325 ( genome.ou.edu/staph.html ; ST8) und COL (
https://www.jcvi.org/ ; ST250), sind ebenfalls sehr eng miteinander verwandt und unterscheiden sich bei nur einer MLST Ort.
Grad und Art der genetischen Vielfalt zwischen MSSA476 und MW2. MW2 und MSSA476 sind zwei in der Gemeinschaft erworbene invasive Stämme, die aus verschiedenen geografischen Gebieten isoliert wurden (MW2 wurde 1998 in den USA isoliert) ( 3 ) und deren Genotyp durch MLST nicht unterscheidbar ist, die sich jedoch in ihrer Empfindlichkeit gegenüber Methicillin unterscheiden. Der globale Vergleich zeigt drei große Unterschiede, die auf mindestens fünf separate horizontale Gentransferereignisse zurückzuführen sind. MSSA476 fehlt die SCC- mec- Typ-IV-Kassette, die SaPI3-Pathogenitätsinsel und der Bakteriophage φSa2 (MW2) ( 6 ), er enthält jedoch SCC 476 und den Bakteriophagen φSa4 (476) ( Tabelle 1 ). Diese genomischen Unterschiede spiegeln sich in den phänotypischen Unterschieden zwischen den Stämmen wider. Insbesondere MSSA476 ist anfällig für Methicillin und es fehlen drei Toxine, einschließlich des Panton-Valentine-Leukocidin-Toxins, das mit einer nekrotisierenden Pneumonie assoziiert ist ( 26 ). Im Gegensatz zu diesen großen Unterschieden im Gengehalt ist die Sequenz des Kerngenoms von MSSA476 und MW2 äußerst ähnlich, wie von MLST vorhergesagt. Eine Untersuchung aller orthologen CDSs in diesen beiden Genomen ergab nur 285 Einzelnukleotidpolymorphismen innerhalb funktioneller kodierender Regionen. Ein hoher Anteil dieser Mutationen (70%) war nicht synonym, was die Möglichkeit eröffnet, dass sie eine gewisse adaptive Bedeutung haben könnten. Diese Beobachtung lässt sich jedoch einfacher erklären, wenn man davon ausgeht, dass diese jüngsten Mutationen leicht schädlich sind, die reinigende Selektion jedoch noch keine Zeit hatte, sie aus der Population zu entfernen ( 7 ).
Grad der genetischen Vielfalt zwischen dem phylogenetisch unterschiedlichen MRSA252 und anderen S. aureus- Stämmen. Vergleiche der phylogenetisch unterschiedlichen Genome von MRSA252, MSSA476 und N315 unter Verwendung von Blastn (Score Cut-Off bei 100) wurden verwendet, um DNA-Regionen zu identifizieren, die für die einzelnen Stämme einzigartig waren. In diesen Regionen wurden 166 CDS in MRSA252 (6,1% der Gesamtzahl der CDS in MRSA252) kodiert, verglichen mit 109 CDS (4,2%) in MSSA476 und 54 CDS (2,1%) in N315. Viele der in MRSA252 gefundenen einzigartigen CDSs sind in kleinen Regionen insertierter DNA zu finden ( Abb. 1 ). Solche Regionen wurden früher als "genomische Inseln" bezeichnet und in den Genomen anderer Arten pathogener Bakterien (z. B. Escherichia coli O157 und Salmonella enterica serovar Typhi) beobachtet ( 27 , 28 ). In diesen Inseln wurden einundvierzig MRSA252-spezifische CDS gefunden, was ungefähr 1,5% der gesamten CDS entspricht (siehe Tabelle 4, die als unterstützende Information auf der PNAS-Website veröffentlicht ist). Vierundzwanzig CDSs sind Inseln mit drei CDSs oder weniger zugeordnet. Die anderen 17 sind in zwei Regionen von 7 und 10 CDS zu finden, von denen die größere stromabwärts des SCC- me c-Elements vom Typ II liegt. Die Analyse der vorhergesagten Funktionen von CDS in diesen Regionen konnte keine Virulenzfaktoren identifizieren. Viele der CDS sollen Stoffwechsel- und Transportfunktionen haben und können daher das metabolische Repertoire von MRSA252 erweitern.
Diskussion
In den letzten 50 Jahren hat S. aureus inkrementelle Veränderungen im genetischen Komplement erfahren, die zur Entstehung von Stämmen geführt haben, die Antibiotika-resistent sind und im Krankenhaus anscheinend erfolgreich übertragen werden und Krankheiten verursachen. In jüngerer Zeit scheinen sich MRSA-Stämme in der Gemeinschaft etabliert zu haben. MLST hat gezeigt, dass, obwohl viele verschiedene genetische Linien in Krankenhäusern und Gemeinden invasive Krankheiten verursachen, nur eine begrenzte Anzahl von ihnen SCC mec erworben und zu erfolgreichen MRSA-Klonen geworden ist ( 29 ).
Mehrere Krankenhaus-MRSA-Klone sind multiresistent geworden, und in jedem von ihnen wurde, obwohl selten, eine verringerte Vancomycin-Empfindlichkeit festgestellt ( 30 ). Es besteht kaum ein Zweifel, dass sich Vancomycin-Resistenz-Gene ( VanA- Gene) in S. aureus etablieren und sich auch in erfolgreiche Krankenhaus-MRSA-Linien ausbreiten würden. Ein besseres Verständnis der Merkmale, die MSSA- und MRSA-Stämme sowohl in der Gemeinde als auch im Krankenhaus erfolgreich machen, ist dringend erforderlich. Die Sequenzierung verschiedener S. aureus- Stämme erleichtert die Beschreibung des gesamten Spektrums der mutmaßlichen pathogenen Determinanten, die von dieser Spezies getragen werden, und bietet eine Grundlage für die Vorhersage der horizontalen Gentransferraten. Solche Informationen könnten Hinweise auf die beobachtete Variabilität der Pathogenese verschiedener Stämme liefern und zukünftige Bemühungen zur Vorbeugung und Behandlung der schweren S. aureus- Krankheit aufzeigen . Die im Rahmen dieses Projekts für die Sequenzierung ausgewählten Stämme ähnelten phylogenetisch (MSSA476) und unterschieden sich deutlich von zuvor sequenzierten Isolaten (MRSA252) ( Abb. 3 ), wodurch die Menge der generierten informativen Daten maximiert wurde.
Einer der wichtigsten Befunde dieser Studie ist, dass ~ 6% des MRSA252-Genoms im Vergleich zu anderen veröffentlichten S. aureus- Genomen, einschließlich der anderen im Krankenhaus erworbenen MRSA-Stämme, bisher nicht beschrieben wurden. Diese zusätzlichen Gene fallen in die Zubehörkategorie. MRSA252 gehört zu den klinisch wichtigen EMRSA-16-Klonen, die für die Hälfte aller MRSA-Infektionen in Großbritannien verantwortlich sind ( 8 ), und der kürzliche Nachweis von EMRSA-16-Isolaten in mehreren anderen Ländern hat das Pandemiepotenzial dieses Klons aufgezeigt ( 9 , 31 ). Die beobachtete genetische Vielfalt wurde durch zahlreiche Mechanismen hervorgerufen, die den horizontalen Erwerb von mobiler DNA sowohl im großen als auch im kleinen Maßstab beinhalteten. Beispielsweise enthält das MRSA252-Genom Beispiele von zwei zuvor nicht charakterisierten genomischen Inseln, die zusammen mit neuen Allelvarianten zuvor charakterisierter Inseln ( 6 ) horizontal übertragen zu werden scheinen. Die Genakkretion wurde in MRSA252 auch durch den Erwerb genomischer Inseln ergänzt. Das Vorhandensein von Genen, die mutmaßliche Stoffwechselfunktionen in vielen dieser Inseln codieren, kann das Überleben und das Wachstum dieses Stammes in der Krankenhausumgebung verbessern und somit zum Erfolg von EMRSA-16 beitragen.
Die Unterscheidbarkeit des MRSA252-Genoms spiegelt wahrscheinlich auch die Auswahl der bisher sequenzierten Stämme wider. MRSA252 unterscheidet sich stark von den Stämmen MSSA476, MW2, N315, Mu50 und NCTC8325 und COL (deren Genome noch nicht veröffentlicht sind), die sich alle auf einem phylogenetischen Baum zusammenballen und nur einen Bruchteil der Vielfalt innerhalb der Spezies insgesamt darstellen ( 7 ) ( Fig. 3 ). Diese Verzerrung hat praktische Auswirkungen auf die postgenomische Analyse, beispielsweise während der Konstruktion von Mikroarrays, die darauf abzielen, das vollständige Komplement von akzessorischen Genen innerhalb der Art S. aureus einzuschließen . Wir sagen voraus, dass viele der hier identifizierten Gene an anderer Stelle gefunden werden, sobald eine repräsentativere Probe der S. aureus- Population sequenziert wurde, und dass zusätzliche Gene gefunden werden, insbesondere wenn die Wahl der Stämme die Stammphylogenie berücksichtigt.
Globale Vergleiche der fünf veröffentlichten Genome zeigten deutliche Unterschiede in der Verteilung der Genominseln, was darauf hinweist, dass die mobile DNA in der S. aureus- Population leicht ausgetauscht werden kann. Das Potenzial für eine schnelle Entwicklung von Stämmen über diesen Mechanismus wird durch den Vergleich der beiden in der Gemeinschaft erworbenen Stämme MSSA476 und MW2 deutlich, die sehr eng miteinander verwandt sind. Durch den Vergleich ihrer Genome ist es möglich, die Prozesse, durch die genetische Variation während der kurzfristigen Entwicklung von S. aureus und während des Auftretens von MRSA-Stämmen aus MSSA-Stämmen entsteht, im Detail zu untersuchen. Ein solcher Vergleich zeigt auch Regionen des Genoms auf, die sich mit außergewöhnlicher Geschwindigkeit entwickeln. Offenbar gab es mindestens fünf verschiedene Akquisitions- oder Verlustereignisse, die diese Stämme unterschieden, was zu deutlich unterschiedlichen Repertoires für Virulenzfaktoren und Arzneimittelresistenzen führte. Eine rasche Ausbreitung genetischer Elemente wird auch durch ihre phylogenetische Verteilung nahegelegt, die nicht mit der von MLST abgeleiteten genetischen Verwandtschaft korreliert. Diese fehlende Korrelation legt nahe, dass mobile Elemente den Austausch von Virulenzfaktoren und Antibiotikaresistenz-Determinanten zwischen S. aureus- Linien erleichtern und zu raschen Änderungen des pathogenen Potenzials oder der Arzneimittelresistenz von Stämmen führen können. Es ist erwähnenswert, dass alle bis auf eine der Antibiotikaresistenz-Determinanten, die das Antibiotikaresistenz-Profil von MRSA252 ausmachen, auf mobilen genetischen Elementen kodiert sind.
In der Gemeinde und im Krankenhaus erworbene MRSA entwickeln sich nach dem Erwerb von SCC mec aus der vorherrschenden MSSA ( 29 ). Krankenhaus-MRSA enthalten einen von vier SCC- MEC- Typen (I-IV). Die Entstehung von in der Gemeinschaft erworbenem MRSA ist jedoch überwiegend mit der Akquisition von SCC- MEC IV ( 32 ) verbunden, dem kleinsten Element, das nur Resistenz gegen β-Lactame verleiht . Gemeinschafts-MRSA sind genetisch vielfältiger als Krankenhaus-MRSA ( 4 ), da SCC mec IV häufiger als andere SCC mec- Typen erworben wurde ( 33 ). Der sequenzierte, in der Community erworbene MRSA-Stamm MW2 wird von MLST ST1 zugeordnet, der zuvor als Ursache für invasive Erkrankungen in der Community identifiziert wurde ( 3 , 10 ). Überraschenderweise trägt MSSA476, ein ST1 zugeordnetes MSSA-Isolat, ebenfalls SCC 476 , enthält jedoch kein mec- Gen. Das Vorhandensein eines mutmaßlichen Gens zur Resistenz gegen Fusidinsäure in SCC 476 unterstreicht das Potenzial dieser Elemente als Träger für Gene, die in Abwesenheit von Methicillin einen selektiven Vorteil bieten. Das Fehlen einer allgemeinen Ähnlichkeit in Verbindung mit der Sequenzdivergenz konservierter Komponenten ( ccrA und ccrB ) macht es unwahrscheinlich, dass SCC 476 von SCC mec abgeleitet ist. Daher stellt SCC 476 einen neuen Typ eines SCC-Antibiotika-Resistenz tragenden Elements (SCC far ) dar, der sich von SCC mec unterscheidet und die potenzielle Ausbreitung der Fusidinsäure-Resistenz durch horizontalen Gentransfer anzeigt. Unsere Ergebnisse lassen auch vermuten, dass SCC-Elemente unabhängig vom mec- Gen leicht durch die S. aureus- Population (und möglicherweise durch andere Mitglieder der Gattung) übertragen werden und dass zuvor nicht nachgewiesene SCC in MSSA-Stämmen häufig sind. Eine Untersuchung der Prävalenz und der Rolle solcher Elemente bei der Verbreitung von Antibiotikaresistenzgenen, mutmaßlichen Virulenzfaktoren und Genen, die die bakterielle Fitness verbessern, ist erforderlich. Wir schlagen vor, dass eine zusätzliche Sequenzierung weiterer verschiedener klinischer Stämme mit bekanntem Epidemiepotential zu unserem Verständnis der Evolution und Virulenz von S. aureus beitragen wird.
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