Speziell für Heather, aber auch natürlich für alle anderen Interessierten;
ich hoffe es ist keine Wiederholung und es gibt genug Geduld beim lesen:
Massenspektrometrie ergänzt biochemische und molekularbiologische Diagnostik von Fettsäure- und Aminosäurestoffwechselstörungen.
Der größte Teil des Fettsäure- und Aminosäureabbaus ist intramitochondrial lokalisiert. Störungen dieser Stoffwechselwege führen zu metabolischen Erkrankungen, die meist das Neugeborene, seltener ältere Kinder oder Erwachsene betreffen. Die Enzymdefekte werden durch erhöhte Metabolite charakterisiert, die sich vor dem betroffenen Enzym anstauen. Die Technik der Tandem-Massenspektrometrie erlaubt heute, aus wenigen Mikrolitern Blut eine Vielzahl dieser diagnostisch wegweisenden Metabolite zu bestimmen. In vielen Fällen kann dadurch bereits ohne Hinzuziehen aufwendiger und teilweise invasiver Methoden die richtige Diagnose gestellt werden. Der vorliegende Übersichtsartikel stellt die Funktionsweise der Tandem-Massenspektrometrie vor, behandelt die Biochemie, Pathobiochemie und Therapie ausgewählter Fettsäure- und Aminosäureabbaustörungen und demonstriert den Stellenwert der neuen Technik anhand typischer Beispiele.
Schlüsselwörter: Tandem-Massenspektrometrie, angeborene Stoffwechselstörung, Fettsäureoxidation, Organoazidurie, Aminosäuremetabolismus
Störungen des Fettsäure- und Aminosäurestoffwechsels werden in der Mehrzahl durch mitochondrial lokalisierte Enzymdefekte verursacht und in der Regel autosomal-rezessiv vererbt. Sie haben wie die anderen typischen mitochondrialen Funktionsstörungen (siehe erster Teil, Heft 46 vom 19. November 1999) eine eingeschränkte metabolische Energiegewinnung zur Folge und führen häufig bereits im Neugeborenen- oder Kleinkindalter zu schweren Stoffwechselentgleisungen. Die Anhäufung spezifischer Metabolite vor dem betroffenen Enzym ist ursächlich an der Pathogenese der Stoffwechselkrisen beteiligt und in vielen Fällen diagnostisch wegweisend. Die Tandem-Massenspektrometrie erlaubt heute eine zuverlässige Bestimmung dieser Metabolite im Patientenserum und damit eine schnelle und sichere Diagnostik dieser speziellen Formen von Stoffwechselstörungen.
Störungen des Fettsäureabbaus
Der Abbau der Fettsäuren ist vollständig intramitochondrial lokalisiert (Grafik 1). Er kann schematisch in drei Teilbereiche gegliedert werden:
- die Aktivierung der langkettigen Fettsäuren und deren Transport über die mitochondriale Innenmembran mit Hilfe des sogenannten Carnitin-Shuttles,
- die b-Oxidation der aktivierten Fettsäuren unter Bildung von Acetyl-CoA,
- die Übertragung der Reduktionsäquivalente auf die Atmungskette, die eng mit der Energiegewinnung in Form von ATP verbunden ist.
Langkettige Fettsäuren gelangen unter Vermittlung des sogenannten Carnitin-Shuttles in die mitochondriale Matrix. Dieser besteht aus drei Komponenten: der Carnitin-Palmityl-Transferase I (CPT-I; * in Grafik 1), der Carnitin-Acylcarnitin-Translokase (¯) und der CPT-II (®). Der Carnitin-Shuttle kann nur funktionieren, wenn über den plasmamembranständigen Carnitin-Transporter («) ausreichend freies Carnitin in die Zelle aufgenommen wird. Langkettige Fettsäuren werden als Carnitinester durch die Innenmembran transportiert und in der Matrix als Acyl-CoA in der b-Oxidation schrittweise durch Abspaltung von C2-Einheiten verkürzt, bis sie komplett zu Acetyl-CoA abgebaut sind (° ±). Die im Verlauf der b-Oxidation entstehenden Reduktionsäquivalente (FADH2 und NADH) werden in der Atmungskette zur Energiegewinnung herangezogen (²), während das Acetyl-CoA in den Zitrat-Zyklus eingeschleust wird.
Die Oxidation von Fettsäuren kann unter katabolen Stoffwechsellagen bis zu 80 Prozent der gesamten metabolischen Energie liefern. Insbesondere Herz- und Skelettmuskel sind auf die Energiegewinnung aus Fettsäuren angewiesen. Während normalerweise die Glykogenreserven durch Bevorzugung der sehr energiereichen Fettsäuren lange Zeit erhalten bleiben, kommt es bei Störungen im Fettsäuremetabolismus in Folge des vermehrten Glukoseabbaus nach etwa zwölfstündigem Fasten zu schweren Hypoglykämien bis hin zum Koma. Ebenso wichtig ist, daß die Leber Fettsäuren zur Ketonkörper-Synthese benutzt und dabei gleichzeitig Energie für die Glukoneogenese und die Harnstoffsynthese gewinnt. Typisch für Fettsäureoxidationsdeffekte ist daher eine hypoketotische Hypoglykämie, manchmal kombiniert mit einer Hyperammonämie. Knapp 20 Defekte der Fettsäure-Oxidation sind gegenwärtig bekannt (13). Nahezu alle manifestieren sich in früher Kindheit mit akuten lebensbedrohenden metabolischen Krisen. Einige Erkrankungen zeigen eine chronische Skelettmuskelschwäche oder akute belastungsabhängige Rhabdomyolysen sowie eine akute oder chronische Kardiomyopathie. Die rechtzeitige Erkennung einer Fettsäurestoffwechsel-Erkrankung kann schwierig sein, da die Patienten vor dem erstmaligen Auftreten einer Stoffwechselkrise ein völlig unauffälliges klinisches Bild zeigen können.
Ursache und Pathogenese mitochondrialer Fettsäureoxidationsstörungen
Carnitin-Mangelzustände
- Primärer Carnitin-Mangel:
Primäre systemische Carnitin-Defizienz (OMIM 212140, Online Mendelian Inheritance in Man, https:// www3.ncbi.nlm.nih.gov/omim/) (« in Grafik 1)
Ursache dieser sehr seltenen Erkrankung sind Mutationen im Carnitin-Transporter der Plasmamembran, OCTN2 (12, 14). Sie führen zu einer mangelnden Aufnahme von Carnitin ins Zytoplasma von Herz- und Skelettmuskelzelle. Carnitin kann außerdem im Nierentubulus nicht mehr rückresorbiert werden und wird mit dem Urin ausgeschieden, was zu einem zunehmenden Carnitin-Verlust führt. Der resultierende "systemische" Carnitin-Mangel im Serum und in der Herz- und Skelettmuskulatur führt bereits in den ersten Lebensmonaten zu einer progressiven Kardiomyopathie, Fettspeicher-Myopathie, Hypoglykämie und Hyperammonämie.
- Sekundärer Carnitin-Mangel: Als sekundären Carnitin-Mangel () hingegen bezeichnet man Zustände, bei denen Carnitin im Gefolge anderer Erkrankungen erniedrigt ist. In der Regel fallen bei diesen Erkrankungen Metabolite an, die mit freiem Carnitin zu Carnitinestern reagieren können. Sekundäre Carnitin-Mangelzustände werden beschrieben bei Organoazidurien wie auch als Folge bestimmter Behandlungsformen (beispielsweise Valproat-Therapie, Dialyse) oder bei Malnutrition.
Erkrankungen des Carnitin/ Acyl-Carnitin-Transportsystems
Carnitin-Palmityl-Transferase-Mangel: Carnitin-Palmityl-Transferase-(CPT-)Mängel unterteilen sich in einen muskulären Mangel, der die CPT II betrifft (®) und vorwiegend im frühen Erwachsenenalter (OMIM 255110), selten auch bei Neugeborenen (OMIM 600649) auftritt, und den seltener vorkommenden infantilen hepatischen Typ, bei dem die Aktivität der Leber-CPT I (*) vollständig fehlt (OMIM 255120). Die in der Kindheit auftretenden CPT-Mängel sind durch schwere Hypoglykämien und Hypoketonämien gekennzeichnet, der adulte CPT-II-Mangel äußert sich durch eine belastungsinduzierte Rhabdomyolyse.
Carnitin-Translokase-Mangel:
Ein Carnitin-Translokase-Mangel (¯) (OMIM 212138) betrifft das eigentliche Transportprotein, das den Übertritt von Fettsäuren von der zytosolischen Seite der mitochondrialen Innenmembran in die Matrix bewerkstelligt, wo die eigentliche b-Oxidation stattfindet. Die Erkrankung verläuft klinisch meist schwer und ist durch nichtketotische Hypoglykämie, Muskelschwäche und meist Kardiomyopathie gekennzeichnet (9).
Defekte der b-Oxidation:
- SCAD-(Short-Chain-Acyl-CoA- Dehydrogenase-)Defekte (OMIM 201470), (°) sind seltene Erkrankungen, die sich in einer schweren infantilen Form und einem milderen Phänotyp mit vorwiegend muskulärer Affektion manifestieren und denen eine verminderte Oxidation der kurzkettigen Fettsäuren zugrundeliegt.
- MCAD-(Medium-Chain-Acyl-CoA-Dehydrogenase-)Defekte (OMIM 201450), (°) sind die häufigsten Defekte der b-Oxidation. Sie treten in unterschiedlicher Frequenz in den europäischen und nordamerikanischen Ländern auf (Inzidenz 1:10 000 bis 1:100 000). Die häufigste und nur in der weißen Bevölkerung zu findende MCADMutation (etwa 90 Prozent) ist ein A- nach G-Austausch an Nukleotidposition 985 (A985G) (10). Klinisch steht die hepatische Störung der Ketogenese im Vordergrund, charakterisiert durch Intoleranz gegenüber Fasten, Erbrechen, Hypoglykämie, Lethargie und Koma. Ein typisches Carnitinspektrum ist in Grafik 3 dargestellt.
- VLCAD-(Very-Long-Chain-Acyl-CoA-Dehydrogenase-) (OMIM 201475) und LCAD-(Long-Chain-AcylCoA-Dehydrogenase-) (OMIM 201460) Defizienzen (°)
Diese Defekte stellen eine klinisch meist äußerst schwer verlaufende Gruppe der b-Oxidationsdefekte dar. Sie manifestieren sich oft schon in der Neugeborenenperiode mit Episoden von durch Fasten induziertem Koma. Die meisten Patienten zeigen zusätzlich eine chronische Kardiomyopathie. Da bereits der Initialschritt der bOxidation der langkettigen Fettsäuren gestört ist, fällt die Energiegewinnung aus Fettsäuren vollständig aus und das Energiedefizit ist entsprechend schwer.
- Kurz- und Langketten-3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase-Defekte (±)
Defekte der Kurzketten-3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase (SCHAD) sind selten. LCHAD-Defekte (OMIM 143450) hingegen gehören zu den häufigsten Störungen der b-Oxidation. In frühester Kindheit auftretend sind sie gekennzeichnet durch nichtketotische Hypoglykämie, Kardiomyopathie und Skelettmuskelschwäche. In jüngster Zeit wurde eine Assoziation zwischen dem Vorliegen eines fetalen LCHAD-Mangels und dem Auftreten des HELLP-Syndroms (hemolysis, elevated liver enzymes, low platelet count) während der Schwangerschaft erkannt (15), so daß es geboten erscheint, Kinder von Müttern mit HELLP-Syndrom oder Eklampsie auf einen LCHAD-Defekt hin zu untersuchen.
Defekte der energiegenerierenden Kopplung
- ETF und ETF: Q0-Oxidoreduktase-Defekte (²)
Neben den genannten enzymatischen Defekten entlang der mitochondrial lokalisierten Endstrecke der Fettsäureoxidation sind Störungen bei der Kopplung an die "energiegenerierende" Atmungskette beschrieben. Die Acyl-CoA-Deyhdrogenasen der b-Oxidation übertragen ihre energiereichen Elektronen über ein zwischengeschaltetes electron transfer flavoprotein (ETF) auf das Ubiquinon (Q0) der Atmungskette (7). Defekte des ETF- und ETF:Q0-Systems wurden nach älterer Nomenklatur Glutarazidurie Typ II genannt (OMIM 231675 und 231680). Neben einer fatalen Neugeborenenform kommen milder verlaufende juvenile Formen mit hypoglykämischen Attacken, metabolischer Azidose, Hepatomegalie und Muskelschwäche vor.
Therapie und Prognose der Fettsäurestoffwechselstörungen
Die Fettsäureoxidationsstörungen weisen durch die krisenhafte Entwicklung eines durch Fasten induzierten Komas ein hohes Mortalitäts- und Morbiditätsrisiko auf. Bei frühzeitiger Diagnose und Therapie besteht andererseits für die meisten Erkrankungen eine gute Prognose, mit Ausnahme sehr schwer verlaufender Defekte der langkettigen Fettsäureoxidation, bei denen die sich entwickelnde Kardiomyopathie häufig die Lebenserwartung limitiert. Die Therapie zielt darauf ab, die durch das Fasten induzierten Streßzustände durch eine angepaßte Ernährung zu vermeiden. Fastenintervalle sollten zwölf Stunden nicht überschreiten. Insbesondere bei interkurrenten Infektionen kann auch eine kontinuierliche kohlenhydratreiche Sondenernährung indiziert sein. Metabolische Entgleisungen erfordern eine sofortige Infusion von Glukose, wobei ein Glukosespiegel >100 mg/dl anzustreben ist. Eine hochdosierte Substitution mit L-Carnitin (100 mg/kg) ist für Kinder mit primärem systemischen Carnitinmangel lebensrettend, während ihr Erfolg bei anderen Fettsäureoxidationsstörungen mit sekundärem Carnitinmangel kontrovers diskutiert wird.
Störungen des Aminosäureabbaus
Der Abbau der verzweigtkettigen Aminosäuren Leuzin, Isoleuzin und Valin (Grafik 2), der bis auf den ersten Schritt in der mitochondrialen Matrix stattfindet, dient ebenfalls der Energiegewinnung, da die Endprodukte, Acetyl-CoA und Succinyl-CoA, in den Zitrat-Zyklus eingeschleust werden können. Der Abbau von Leuzin liefert unter anderem Acetoacetat, einen Ketonkörper, der im Fastenzustand der Energiegewinnung in Herz- und Skelettmuskel dient. Störungen dieser Abbauwege werden im folgenden anhand ausgewählter Beispiele besprochen.
- Propionazidurie (OMIM 232050), (³ in Grafik 2 und 4)
Beim Abbau der Aminosäuren Isoleuzin, Valin, Methionin und Threonin wie auch beim Abbau von ungeradzahligen Fettsäuren entsteht als Zwischenprodukt Propionyl-CoA, welches zunächst in einer von Biotin abhängigen Reaktion zu Methylmalonyl-CoA carboxyliert wird (6). Ein Mangel an Propionyl-CoA-Carboxylase(PCC-)Aktivität kann entstehen durch Mutationen der a- oder b-Untereinheit der PCC, einen Mangel an Holocarboxylase-Synthetase und einen Mangel an Biotinidase.
Mutationen der PCC führen zum Krankheitsbild der isolierten PCC-Defizienz, die sich als "ketotisches Hyperglyzinämie-Syndrom" mit einer schweren metabolischen Ketoazidose manifestiert, während eine "multiple Carboxylase-Defizienz" zusätzlich durch eine muskuläre Hypotonie, Anfallsleiden, Alopezie, Hautveränderungen und Entwicklungsverzögerungen gekennzeichnet ist.
- Methylmalonazidurie (OMIM 251000, 261100 und 275350), (´ in Grafik 2 und 4)
Methylmalonyl-CoA wird in einer von Vitamin B12 abhängigen Reaktion durch Methylmalonyl-CoA-Mutase zu Succinyl-CoA, einem Intermediat des Zitrat-Zyklus umgelagert. Ein Mangel an Methylmalonyl-CoA-Mutase-Aktivität führt zur Methylmalonazidurie (6). Entstehen kann ein solcher Mangel durch Mutationen am Apomutase-Locus, durch Synthesedefekte des Adenosyl-Cobalamins sowie durch Synthesedefekte, die sowohl Adenosyl-Cobalamin als auch Methyl-Cobalamin betreffen. Da Methyl-Cobalamin ein Cofaktor der Methionin-Synthase ist, resultieren diese Defekte in einer Kombination aus Methylmalonazidurie und Homozystinurie.
- 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-CoA-Lyase-Mangel (OMIM 246450), (µ in Grafik 2 und 5)
Der letzte Schritt des Leuzinabbaus und gleichzeitig der geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Genese von Ketonkörpern ist die Spaltung von 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-(HMG)-CoA zu Acetoacetat und Acetyl-CoA durch die HMG-CoA-Lyase (HMGCL). Mutationen der HMGCL (Häufigkeit etwa 1 : 50000) machen sich im ersten Lebensjahr durch schwere Hypoglykämie, hypoketotische metabolische Azidose, Hyperammonämie, Erbrechen und Koma bemerkbar (11).
- Glutarazidurie Typ I (OMIM 231670), ( in Grafik 2 und 5):
Beim intramitochondrialen Abbau von Lysin, Tryptophan und Hydroxylysin entsteht als Zwischenprodukt Glutaryl-CoA, welches durch die Glutaryl-CoA-Dehydrogenase weiter abgebaut wird (8). Ein Defekt dieses Enzyms äußert sich im Kleinkindalter mit neurologischen Defekten (Dystonie, Dyskinesie, Choreoathetose) und enzephalitischen Zeichen ohne Fieber. Oft liegt bei Geburt ein Makrozephalus vor. Im NMR finden sich Aufweitung der insulären Zisternen, frontotemporale Atrophie sowie Degenerationszeichen im Bereich des Striatum.
Therapie und Prognose der Aminosäureabbaustörungen
Auch bei den Organoazidurien, zu denen die oben genannten Erkrankungen gehören, kommen krisenhafte, akut lebensbedrohende metabolische Entgleisungen vor, bei denen eine sofortige wirkungsvolle Entfernung der toxischen Metabolite durchgeführt werden muß. Die Langzeitprognose wird von der strikten lebenslangen Einhaltung einer speziellen Diät bestimmt, die die Metabolitkonzentration in den Normalbereich senken muß und andererseits eine ausreichende Versorgung mit essentiellen Aminosäuren sicherstellt. Zur Vermeidung einer sekundären metabolischen Krise ist bei Carnitin-Mangel die orale Substitution angezeigt.
Diagnostik mit Tandem-Massenspektrometrie
Viele der oben genannten Erkrankungen konnten bisher nur durch aufwendige biochemische Aktivitätsmessungen der betreffenden Enzyme in Hautfibroblasten nachgewiesen werden. Heute steht mit der Tandem-Massenspektrometrie (Tandem-MS) ein schnelles, wenig invasives Verfahren zur Verfügung, das in vielen Fällen aufgrund eines charakteristischen Musters akkumulierter Metabolite eine spezifische Diagnose erlaubt. Für Kleinkinder besonders wichtig ist, daß nur eine geringe Menge Serum (50 µl) benötigt wird. Bei klinischem Verdacht auf eine Fett- oder Aminosäurestoffwechselerkrankung sollte daher ein spezialisiertes und in der Befundung dieser seltenen Stoffwechselstörungen erfahrenes Labor konsultiert werden. Im Notfall kann die Untersuchung innerhalb weniger Stunden durchgeführt werden. Parallel dazu empfiehlt sich eine Untersuchung des Urins auf organische Säuren, da die Kombination beider Methoden eine höhere Sensitivität ergibt. Da das Carnitin-Muster häufig bereits die Sicherung der Diagnose erlaubt, ist nur mehr in seltenen Fällen eine invasive Diagnostik notwendig.
Tandem-MS und Neugeborenen-Screening
Ein Großteil der vorab genannten Erkrankungen manifestiert sich bereits in den ersten Lebenswochen. Die Frage, inwieweit sich die Tandem-MS zum Neugeborenen-Screening einsetzen läßt, ist daher naheliegend und wird von verschiedenen Arbeitsgruppen bearbeitet. Den strengen Kriterien des Neugeborenen-Screenings entsprechend, die eine sehr sichere Analytik (keine falsch negativen, geringer Prozentsatz falsch positiver Befunde) bei behandelbaren Erkrankungen voraussetzen, ist eine entsprechende Auswahl an Krankheiten zu treffen und es sind ausgedehnte Vorarbeiten zu leisten. Der sicherste und schnellste Weg, hier zu aussagekräftigen Ergebnissen zu kommen, ist die retrospektive Analyse der Filterpapierproben aus dem Neugeborenen-Screening derjenigen Kinder, bei denen sich später eine mitochondriale Erkrankung manifestierte. Ein in Bayern seit Januar 1999 laufendes, zunächst auf drei Jahre befristetes Modellprojekt beinhaltet acht Erkrankungen, die mit Tandem-MS untersucht werden (Ahornsirup-Erkrankung (2), Glutarazidurie Typ I, Homozystinurie (3), Isovalerianazidämie, MCAD-Mangel (4), Methylmalonazidurie, Phenylketonurie (1) und Propionazidurie). Neben unbestreitbaren meßtechnischen Verbesserungen bei bereits etablierten gescreenten Erkrankungen (geringere Rate falsch positiver Befunde bei Phenylketonurie) wurde beispielsweise bei MCADMangel vereinzelt über falsch negative Resultate berichtet. Die Methode sowie die Auswahl der Erkrankungen bedürfen daher noch einer ausgedehnten Evaluation, bevor allgemeine Empfehlungen zum NeugeborenenScreening ausgesprochen werden können.
-Transport und b-Oxidation. Langkettige Fettsäuren aus der Spaltung von Triglyceriden werden nach dem Durchtritt durch die Plasmamembran (PM) zu Acyl-CoA-Estern aktiviert. Die CoA-Ester werden von der CPT I (Abkürzungen siehe im Text) in Acyl-Carnitin umgewandelt, mit Hilfe einer Carnitin/Acyl-CarnitinTranslokase über die Innenmembran transportiert und von der CPT II wieder in Acyl-CoA umgewandelt. Ein Natrium-abhängiger Carnitin-Transporter in der Plasmamembran (OCTN2) stellt freies Carnitin für diesen Prozeß zur Verfügung. In der mitochondrialen Matrix findet die b-Oxidation der Fettsäuren statt. Deren Endprodukte FADH2 und NADH werden in der Atmungskette oxidiert, während Acetyl-CoA in den ZitratZyklus eingeschleust wird.
Störungen mitochondrialer Aminosäureabbauwege. Der Abbau der verzweigtkettigen Aminosäuren Leuzin, Isoleuzin und Valin sowie Lysin und Tryptophan findet zum größten Teil in der mitochondrialen Matrix statt. Die Endprodukte werden entweder in den Zitrat-Zyklus eingeschleust (Acetyl-CoA und Succinyl-CoA) oder dienen als Ketonkörper (Acetoacetat) der Energiebereitstellung. Die Reduktionsäquivalente FADH2 und NADH werden wie bei der Fettsäureoxidation in der Atmungskette zur Energieproduktion verwendet.
MCAD-Mangel. Dargestellt ist ein normales Carnitinspektrum, das den Bereich von freiem Carnitin (m/z = 218) bis zu C18-Carnitinester (m/z = 484; m/z = Masse/Ladung, z = 1) umfaßt. Auf der Abszisse ist die Masse des intakten Carnitinesters angegeben, auf der Ordinate die Intensität der Ionen. Ein normales Carnitinspektrum besteht zu etwa 70 % aus freiem Carnitin (218), die sogenannten Acyl-Carnitine bestehen im wesentlichen aus Acetyl-Carnitin (260). Beim MCAD-Mangel kommt es zu einem verminderten Abbau der Fettsäuren C6-C10. Im Carnitinspektrum eines Neugeborenen findet man deshalb typischerweise eine Vermehrung von C6-Carnitin (316), C8-Carnitin (344) sowie auch C10:1-Carnitin (370); diese einfach ungesättigte Fettsäure entsteht durch vier b-Oxidationszyklen des C18:1, der Ölsäure, einer häufiger vorkommenden Nahrungsfettsäure; diese vier Zyklen werden durch die VLCAD katalysiert.
Propionazidurie und Methylmalonazidurie. Bei der Propionazidurie fällt zusätzlich zu freiem und AcetylCarnitin Propionyl-Carnitin (274) auf, welches sonst nur in Spuren vorkommt. Das Carnitinspektrum eines vierjährigen Kindes mit Methylmalonazidurie, das bereits mit einer Isoleuzin- und Valin-armen Diät ernährt sowie mit Carnitin supplementiert wird, zeigt zusätzlich noch Methylmalonyl-Carnitin (374). Freies Carnitin ist aufgrund der Carnitintherapie erhöht.
HMG-CoA-Lyase-Mangel und Glutarazidurie Typ I. Ein bereits mit spezieller aminosäurearmer Diät und Carnitin therapiertes 6jähriges Kind mit bekanntem HMG-CoA-Lyase-Mangel wurde im beschwerdefreien Intervall untersucht. Der Rückstau vor dem Stoffwechselblock äußert sich im Serum in einer spezifischen Erhöhung von 3-Hydroxy-Isovaleryl-Carnitin (318) und 3-Methylglutaryl-Carnitin (402). Das beim Abbau von Lysin und Tryptophan entstehende Glutaryl-CoA wird bei GA I als Glutaryl-Carnitin (388) gefunden. Andere auffällige Peaks im Bereich der kurz-, mittel- und langkettigen Fettsäuren sind nicht nachweisbar, was eine GA Typ II ausschließt.
Schematische Darstellung des Elektrospray-Tandem-Massenspektrometers
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Autoren
Gerbitz, Klaus-Dieter
Gempel, Klaus
Bauer, Matthias F.
Schlagwörter
Diagnosestellung
Fettsäurenoxidationsstörung
Kongenitale Fehlbildung
Mitochondriale Erkrankung
Molekulare Medizin
Neugeborenenscreening
Zusammenfassung
Das Genom des Menschen ist weitgehend sequenziert, und etwa 30 000 bis 40 000 Gene sind identifiziert. Dies ist ein wichtiger Schritt, um molekularbiologische Abläufe im menschlichen Körper besser zu verstehen. Für die Aufklärung der erblichen Ursachen von Krankheiten ist aber darüber hinaus noch ein weiterer Aspekt von großer Bedeutung: die Kenntnis der individuellen Unterschiede in der Erbinformation, der genetischen Variabilität. Sie stellt den Schlüssel dar, mit dem sich jene genetischen Unterschiede aufspüren lassen, die bestimmte physiologische Abläufe verändern und so zur Entstehung von Krankheiten beitragen. Die Arbeit gibt einen Überblick über die verschiedenen Formen genetischer Variabilität beim Menschen, ihre Häufigkeit und Verteilung. Sie soll damit zum Verständnis der Bedeutung genetischer Variabilität für die Krankheitsforschung beitragen.
Schlüsselwörter: genetische Variabilität, Humangenomprojekt, Gensequenzierung, Molekularbiologie, Genmutation
Das Humangenomprojekt (HGP) wurde im Jahre 1990 vom U.S. Department of Energy (DOE) und den National Institutes of Health (NIH) in Zusammenarbeit mit internationalen Forschungszentren initiiert. Ziel des ambitionierten Projektes war die Entschlüsselung des menschlichen Genoms. Unter Entschlüsselung wurde die Bestimmung der Abfolge aller 3,2 Milliarden DNA-Bausteine (DNA-Sequenz) des haploiden Genoms sowie die Identifizierung aller vorhandenen Gene verstanden.
Ursprünglich auf eine Laufzeit von 15 Jahren angelegt, sorgten enorme Fortschritte in der DNA-Sequenziertechnologie zu Beginn der 90er-Jahre, aber auch ein Wettrennen mit der Privatfirma Celera Genomics (Rockville, MD, USA), für eine enorme Beschleunigung des Projektes. Schließlich wurde bereits fünf Jahre früher als anfänglich geplant, im Juni 2000, unter großer Anteilnahme der Öffentlichkeit das Vorliegen einer nahezu vollständigen DNA-Referenzsequenz des Menschen verkündet. Diese Referenzsequenz umfasst etwa 90 Prozent der euchromatischen (das heißt Gen-reichen) Bereiche des menschlichen Genoms. Bis zum Jahr 2003 sollen noch vorhandene Lücken in der DNA-Sequenz geschlossen und Sequenzierfehler beseitigt werden.
Der Name Humangenomprojekt ist in gewisser Weise missverständlich, impliziert er doch die Existenz eines einzigen menschlichen Genoms. Tatsächlich weiß man heute aber, dass die DNA-Sequenz durch eine erhebliche individuelle Variabilität gekennzeichnet ist. Man kann sagen, dass jeder Mensch ein einzigartiges Genom trägt: Vergleicht man zwei beliebige menschliche Genome miteinander, so stellt man zwar eine 99,9-prozentige Übereinstimmung fest, die verbleibenden 0,1 Prozent jedoch repräsentieren etwa 3 000 000 Sequenzunterschiede. Ein Teil dieser Unterschiede muss für den genetischen Anteil der individuellen Variabilität verantwortlich sein, unter anderem in Bezug auf Aussehen, Persönlichkeit, Begabung und auch Krankheitsdispositionen. Der größere Teil bleibt jedoch sehr wahrscheinlich ohne phänotypische Konsequenz. Es leuchtet sofort ein, dass die Kenntnis von Sequenzvarianten, die für phänotypische Variabilität und Krankheitsdispositionen verantwortlich sind, von außerordentlichem Interesse für die biomedizinische Forschung sind. Weniger selbstverständlich ist die Tatsache, dass auch die anderen, phänotypisch nicht sichtbaren polymorphen Stellen im Genom eine enorme Bedeutung als so genannte genetische Marker haben: Sie stellen Orientierungspunkte in der unübersichtlichen Genomsequenz dar und sind sehr häufig ein wichtiges Werkzeug zur Aufklärung der Ursachen von Erkrankungen.
Die Kenntnis der genetischen Variabilität ist somit von existenzieller Wichtigkeit für die Humangenetik beziehungsweise medizinische Genetik. Einem weiteren Fach, der molekularen Anthropologie, ermöglicht sie einen Zugang zum Ursprung und zur Vergangenheit des Menschen. Dieser Forschungszweig versucht, über die Untersuchung von genetischen Polymorphismen Einblicke in die menschliche Evolution sowie historische Migrationsbewegungen zu erlangen.
Die Frage nach dem Ausmaß der natürlich vorkommenden genetischen Variabilität des Menschen rückte bald nach Beginn des HGP verstärkt in den Vordergrund. Waren bis dahin nur relativ wenige Polymorphismen bekannt (hauptsächlich Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismen [RFLPs] und Minisatelliten), so wurden zu Beginn der 90er-Jahre systematisch Tausende neuer, sehr variabler Polymorphismen (so genannte Mikrosatelliten) in allen Bereichen des Genoms identifiziert, welche eine Orientierung innerhalb des Genoms als Voraussetzung zu seiner Sequenzierung erst ermöglichten.
In den letzten fünf Jahren ist nun ein enormes wissenschaftliches Interesse an einer neuen Klasse von Polymorphismen entstanden, den single nucleotide polymorphisms (SNPs, sprich: snips). Sie machen den weitaus größten Teil der Variabilität im menschlichen Genom aus, und mittlerweile sind bereits mehr als zwei Millionen dieser SNPs bekannt. Anders als die Mikrosatellitenmarker, die eine wichtige Voraussetzung für die Genomsequenzierung waren, ist die Identifizierung von SNPs in großer Zahl und in gleichmäßiger Verteilung erst durch die Kenntnis der Genomsequenz möglich geworden. Eine Reihe in jüngster Zeit veröffentlichter Artikel beschäftigt sich zunehmend damit, die Häufigkeit, Verteilungsmuster und Abhängigkeit der SNPs untereinander für bestimmte Genregionen systematisch aufzuklären und mögliche Unterschiede zwischen Populationen zu detektieren. Diese Arbeit soll einen Überblick über die unterschiedlichen Formen der für die biomedizinische Forschung relevanten genetischen Variabilität, ihre Eigenschaften, Häufigkeit und Verteilung im Genom geben.
Typen genetischer Variabilität beim Menschen
Bis Mitte der 70er-Jahre war die genetische Variabilität auf DNA-Ebene weitgehend unbekannt beziehungsweise technisch nicht nachweisbar. Für genetische Untersuchungen, die eine individuelle Unterscheidbarkeit von Genomabschnitten mittels natürlich vorkommender Polymorphismen (so genannte Marker) erfordern, stand eine sehr beschränkte Zahl von Markern in Form von Blutgruppensystemen, HLA-Typen und einer kleinen Zahl elektrophoretisch nachweisbarer Proteinpolymorphismen zur Verfügung. Diese insgesamt weniger als 100 Marker ließen allein Aussagen über den sehr beschränkten Teil des Genoms zu, auf dem die Gene liegen, welche für diese Proteine kodieren.
Mit Aufkommen der molekulargenetischen Forschung begann die Suche nach Markern direkt auf DNA-Ebene. Diese Marker sollten vor allem zwei Eigenschaften haben: Gleichmäßige Verteilung über das Genom, um Aussagen über den genetischen Einfluss aller chromosomalen Bereiche zu treffen, sowie möglichst hohe Heterozygotieraten und damit genetische Aussagekraft (Informativität). Letztere ist dann gegeben, wenn ein möglichst großer Anteil der untersuchten Personen unterschiedliche Markerallele trägt, also heterozygot für den betrachteten Marker ist (Grafik 1).
Für die genetische Forschung sind seitdem im Wesentlichen vier verschiedene Typen von DNA-Markern von Bedeutung: Mitte der 70er-Jahre wurde die erste Generation genetischer Marker beschrieben, die Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismen (RFLPs). Mitte der 80er-Jahre kamen die Minisatelliten (auch VNTRs genannt, variable number of tandem repeats) hinzu, kurze Zeit später die Mikrosatelliten (STR, short tandem repeats). Seit Ende der 90er-Jahre werden in großem Maßstab single nucleotide polymorphisms (SNPs) verwendet (Grafik 2). Die vier Typen von Markern können grob in zwei Klassen eingeteilt werden, die unterschiedliche Eigenschaften haben.
- Minisatelliten und Mikrosatelliten liegen in der Regel in nichtkodierenden Sequenzen und werden als repetitive Sequenzen bezeichnet, sind also durch ein kurzes, sich mehrfach hintereinander wiederholendes Sequenzmotiv gekennzeichnet (Grafik 2). Daher findet man auch häufig die Bezeichnung simple Sequenzwiederholungen (SSR, simple sequence repeats).
- RFLPs und SNPs liegen sowohl in kodierenden als auch nichtkodierenden Bereichen und stellen Mutationen eines einzelnen Basenpaars, so genannte Einzelbasenaustausche, dar (Grafik 2).
Simple Sequenzwiederholungen
Mini- und Mikrosatelliten bilden einen Teil der Klasse der repetitiven DNA-Sequenzen. Die repetitiven Sequenzen machen mehr als 50 Prozent des Genoms aus und stellen sich wiederholende Sequenzmotive dar, deren Funktion bisher weitgehend unbekannt ist (11, 21). Ihnen gegenüber steht die Klasse der nichtrepetitiven (oder Einzelkopie-) DNA. Weil die Wiederholungseinheiten der Mini- und Mikrosatelliten hintereinander liegen, spricht man auch von tandemartig wiederholten DNA-Sequenzen (Grafik 2).
Minisatelliten liegen in euchromatischen Regionen und haben Grundmotive der Wiederholung von ungefähr 12 bis 500 bp Länge. Sie zeigen zusammen mit den nachfolgend besprochenen Mikrosatelliten die größte interindividuelle Variabilität aller DNA-Sequenzen. Für die meisten dieser Minisatelliten sind mehr als 70 bis 80 Prozent der Menschen einer Population heterozygot, tragen also auf ihren beiden homologen Chromosomen (das heißt väterlichem und mütterlichem Chromosom) zwei unterschiedliche Allele. Diese Marker haben vor allem zu Ende der 80er- und zu Beginn der 90er-Jahre eine große Bedeutung für die humangenetische Forschung und forensische Medizin gehabt. Nachteilig für systematische Untersuchungen des Genoms ist ihre ungleichmäßige Verteilung; die größte Dichte von Minisatelliten beobachtet man in den telomerischen Bereichen, also in den Enden der Chromosomen.
Auch die Mikrosatelliten liegen in euchromatischen Regionen, haben aber kürzere Grundmotive (1 bis 11 bp). Ihre interindividuelle Variabilität ist wie die der Minisatelliten sehr groß. Sie sind experimentell einfacher darstellbar als die Minisatelliten und bieten den Vorteil, gleichmäßig und in großer Zahl über das Genom verteilt zu sein. Sie machen etwa 0,5 Prozent des Gesamtgenoms aus.
In Grafik 3 sind die unterschiedlichen Wiederholungsmotive und ihre relative Häufigkeit im Genom dargestellt. Die positiven Eigenschaften der Mikrosatelliten haben dazu geführt, dass sie zu Beginn der 90er-Jahre zunehmend zu den genetischen Markern der Wahl (zum Beispiel für Kopplungsuntersuchungen) wurden. Als Marker werden vor allem Dinukleotid-Repeats, und hier insbesondere die CA-Wiederholungen (Grafik 2), welche mit einer Zahl von genomweit mehr als 80 000 die häufigste Form darstellen, verwendet. Ohne diese Marker wäre die Kartierung des menschlichen Genoms als eine Grundvoraussetzung zu dessen Sequenzierung vermutlich nicht möglich gewesen.
In der Humangenetik wurde eine sehr große Zahl von Krankheitsgenorten mithilfe dieser Marker in Familien mit den entsprechenden Erkrankungen lokalisiert. Trinukleotid-Repeats sind mit 50 000 bis 60 000 insgesamt seltener im Genom vertreten als Dinukleotid-Repeats, werden aber aufgrund ihrer guten Darstellbarkeit ebenfalls als genetische Marker eingesetzt. Phänotypisch bleiben individuell unterschiedlich lange Repeats in der Regel ohne Auswirkungen.
Eine kleine Zahl von Trinukleotid-Repeats sind in der Humanmedizin allerdings auch als Ursache bestimmter genetischer Krankheiten bekannt, wie zum Beispiel der Chorea Huntington, des fragilen X-Syndroms, der myotonen Dystrophie, der spinobulbären Muskelatrophie Typ Kennedy und verschiedener Typen der spinozerebellären Ataxien. Bei diesen Erkrankungen kommt es in den Keimzellen eines Elternteils zu einer Expansion einer Trinukleotid-Repeat-Sequenz, welche jeweils in einem spezifischen Gen gelegen ist. Durch die Expansion wird das durch das Gen kodierte Protein strukturell oder quantitativ pathologisch verändert und löst in dem aus der Keimzelle hervorgehenden Menschen die Krankheit aus.
Single nucleotide polymorphisms
Sowohl SNPs als auch RFLPs sind Einzelbasensubstitutionen. Man kann RFLPs als eine Untergruppe von SNPs bezeichnen, die innerhalb der Erkennungssequenz für bakterielle Restriktionsenzyme liegen oder durch ihre Anwesenheit neue Erkennungssequenzen generieren. Da dies lediglich durch die Methode der experimentellen Darstellbarkeit
definiert ist, aber keinen genuinen Unterschied hinsichtlich des Typs genetischer Variabilität bedeutet, wird im Folgenden für beide der Begriff SNP verwendet.
Wie man heute weiß, sind SNPs der mit Abstand häufigste Typ genetischer Variabilität beim Menschen; sie machen etwa 90 Prozent der interindividuellen genetischen Variabilität aus (6). Bis Anfang der 90er-Jahre war nur sehr wenig über ihre Häufigkeit, Verteilung und Eigenschaften bekannt, zudem wurde der enorme Wert dieses Wissens oft unterschätzt. Mittlerweile wird eine umfassende Kenntnis der Anzahl von SNPs, ihrer Verteilung in einzelnen genomischen Bereichen (Grafik 4) und in unterschiedlichen Bevölkerungen als der Schlüssel zum Verständnis von in der Bevölkerung häufigen Erkrankungen wie zum Beispiel Diabetes, Hypertonie, kardiovaskuläre und neuropsychiatrische Erkrankungen angesehen. Auch in die krankheitsunabhängige phänotypische Variabilität beim Menschen, die Interaktion von Genen und Umwelt sowie die historische Bevölkerungsentwicklung erhofft man sich durch die systematische Untersuchung von SNPs Einblicke. Verfolgt man nun die enorme Aktivität, mit der seit etwa fünf Jahren an der Identifizierung und Charakterisierung von SNPs gearbeitet wird, so ist es schwer nachzuvollziehen, dass Forscher noch zu Beginn des HGP öffentlich appellieren mussten, im Zuge der Euphorie um die bevorstehende Sequenzierung des Genoms den Aspekt der Identifizierung der genetischen Variabilität, insbesondere der SNPs, nicht zu vernachlässigen (1, 4).
Die Identifizierung von SNPs in großem, genomweitem Maßstab ist sehr kostenaufwendig und für akademische Forschungseinrichtungen allein mit öffentlichen Forschungsgeldern praktisch nicht durchführbar. Aufgrund der potenziellen Bedeutung von SNPs für die pharmazeutische Industrie floss in diese Arbeiten schließlich ein beträchtlicher Anteil privater Gelder. Im Jahre 1999 wurde das SNP-Konsortium (TSC, The SNP Consortium) gegründet, ein Zusammenschluss des britischen Wellcome Trust, zehn großer Pharmafirmen sowie der International SNP Map Working Group, bestehend aus drei US-amerikanischen und einem britischen akademischen Zentrum. Das TSC und das Humangenomprojekt zusammen haben bisher genomweit mehr als 2,1 Millionen SNPs identifiziert, die in einer öffentlich zugänglichen Datenbank (siehe Internetverweis) abgelegt sind. Die im Jahre 1998 gegründete Firma Celera Genomics identifiziert durch Sequenzvergleiche ihrer Sequenzierungsdaten mit den öffentlich zugänglichen Sequenzdaten aus dem Humangenomprojekt ebenfalls in großem Maßstab SNPs, die mit den TSC-SNPs allerdings zu einem Teil identisch sind (21). Die genauen Sequenzdaten dieser SNPs sind gegenwärtig nur gegen Lizenzgebühren an die Firma Celera Genomics zugänglich.
Häufigkeit, Verteilung und Charakteristika von SNPs
Die Zahl der bisher identifizierten SNPs ist beeindruckend groß. Wie steht ihre Zahl aber im Verhältnis zu der tatsächlich in der menschlichen Bevölkerung vorkommenden Zahl von SNPs? Bei einer Mutationsrate von etwa 2 3 10-8 pro Basenpaar und Generation (das heißt 1 Mutation pro 50 Millionen Basen) und einer Populationsgröße von derzeit etwa 6 Milliarden Menschen kann man davon ausgehen, dass jede Basenposition im Genom, an der eine Mutation mit dem Leben vereinbar ist, bereits in der letzten Generation mehrmals mutiert ist (14) – entsprechend häufiger in der Evolution des Menschen. Jede neu entstandene Mutation ist zunächst auf das Gründer-Individuum (bei dem die Mutation aufgetreten ist) beschränkt und breitet sich dann im Laufe der Generationen in der Bevölkerung allmählich aus, sofern kein negativer Selektionsdruck greift oder sie nicht zufällig verloren geht, weil das Gründer-Individuum keine Nachkommen hat oder die Mutation nicht weitervererbt. Erst ab einer minoren Allelfrequenz (Frequenz des weniger häufigen Allels) von etwa einem Prozent in der Bevölkerung werden SNPs für viele genetische Fragestellungen interessant. Anhand der durch die International SNP Map Working Group (20) veröffentlichten SNP-Daten schätzt man, dass es etwa 11 Millionen SNPs gibt, deren minores Allel eine Frequenz von wenigstens einem Prozent in der Weltbevölkerung hat (Tabelle 1). Diese SNPs kommen durchschnittlich wahrscheinlich alle 290 bp vor. Evolutionär ältere SNPs mit höheren minoren Allelfrequenzen sind erwartungsgemäß seltener: SNPs mit einer minoren Allelfrequenz von 40 Prozent treten mit einer geschätzten Häufigkeit von 1 auf 3 280 bp auf. Wie erläutert, kann man an jeder beliebigen Position des Genoms einen Basenaustausch erwarten, sofern man in der gesamten Weltbevölkerung danach suchen würde und sofern dieser Basenaustausch mit dem Leben vereinbar ist. Eine bessere Vorstellung von dem Ausmaß der tatsächlich für genetische Untersuchungen relevanten Variabilität erhält man, wenn man die „Nukleotid-Diversität“ angibt. Dieser Wert gibt die Frequenz von Basenaustauschen an, die man durchschnittlich beim Vergleich zweier beliebiger genomischer Regionen oder Chromosomen in der Bevölkerung beobachtet. Er ist ein normalisiertes (das heißt ein nach Stichprobengrößen korrigiertes) Maß für die genetische Variabilität, die auch Studien vergleichbar macht, welche die Variabilität einer bestimmten genomischen Region in unterschiedlich großen Stichprobenzahlen ermittelt haben.
Nukleotid-Diversität im Genom
Die Sequenzierungsdaten des Humangenomprojektes und des TSC geben einen guten Überblick über die genomweite Variabilität in der menschlichen Nukleotid-Sequenz. Aufgrund dieser Daten ergibt sich, dass man in zwei zufällig aus der Population ausgewählten Chromosomen eine durchschnittliche Nukleotid-Diversität von 7,51 heterozygoten Stellen in 10 000 bp, anders ausgedrückt 1 SNP pro 1 331 bp, erwarten kann (20). Die Nukleotid-Diversität der Autosomen (Chromosomen 1 bis 22) ist relativ ähnlich, eine deutlich geringere Nukleotid-Diversität weisen hingegen die Geschlechtschromosomen auf, deren Werte bei 1 SNP pro 2 132 bp für das X-Chromosom und 1 SNP pro 6 623 bp für das Y-Chromosom liegen. Dies ist wahrscheinlich das Resultat ihrer geringeren Anzahl im Vergleich zur Zahl der Autosomen, denn der Grad der Variabilität eines Chromosoms ist eng mit seiner Häufigkeit in der Bevölkerung korreliert. So kommen auf 100 Autosomen in der Population nur 75 X-Chromosomen und 25 Y-Chromosomen.
Die zumindest zwischen den Autosomen relativ ähnlichen Nukleotid-Diversitätswerte bedeuten jedoch nicht, dass an jeder beliebigen Stelle des Genoms ein gleiches Maß an Variabilität zu finden ist. Vielmehr scheint es, als ob erhebliche Unterschiede in der Variabilität einzelner chromosomaler Regionen bestehen (2, 3, 5, 9, 10, 13, 15–18, 20, 23–25). So konnte beispielhaft für Chromosom 6 gezeigt werden, dass sich die Nukleotid-Diversität zwischen verschiedenen Regionen sich bis zu 30fach unterscheidet. Die am wenigsten variablen Bereiche des Chromosoms zeigen Werte von etwa 1 SNP pro 10 000 bp, die variabelsten Bereiche hingegen Werte von etwa 1 SNP pro 333 bp. Dabei beobachtet man auch zwischen eng benachbarten chromosomalen Bereichen große Schwankungen (20).
Die zweifellos höchste Nukleotid-Diversität liegt im mitochondrialen Genom vor. Das mitochondriale Genom ist in den im Zytoplasma der Zelle befindlichen Mitochondrien lokalisiert und im Vergleich mit dem im Zellkern gelegenen (nukleären) Genom mit 16 569 bp wesentlich kleiner. Die ringförmig geschlossene mitochondriale DNA (mt-DNA) kodiert im Wesentlichen Untereinheiten der Atmungskette, die mit ihrer ATP-Produktion die Energieversorgung der Zelle gewährleisten. Aufgrund ineffizienterer DNA-Schutz- und -Reparaturmechnismen sowie der mutagenen Wirkung von Sauerstoff-Radikalen, die in der Atmungskette entstehen, ist die Mutationsrate wenigstens zehnfach höher als im Zellkern (22). Als Resultat ist eine Vielzahl von Erkrankungen beschrieben, die auf Mutationen in der mtDNA zurückgehen (8, 12). Charakteristisch ist die ausschließlich maternale Vererbung, da die Mitochondrien – und damit auch die mt-
DNA – nur über die mütterlichen Eizellen an die nächste Generation vererbt werden. Als Folge der hohen Mutationsrate häufen sich zudem in vielen Geweben während des Lebens somatische (und damit nichterbliche) Mutationen in der mtDNA an und führen zu einer allmählichen Verschlechterung der zellulären Energieproduktion. Dies hat insbesondere Auswirkungen auf die Funktion von Geweben mit hohem Energiebedarf, wie Skelettmuskel, ZNS, Herz, Ohr, Auge und Endokrinium (12) und wird als eine Ursache des Alterns angesehen. Daneben existiert eine große Zahl von neutralen, erblichen polymorphen Stellen in der mtDNA (22). Viele dieser Unterschiede sind aufgrund der kontinuierlich hohen Mutationsrate erst nach der Aufspaltung und geographischen Trennung verschiedener Populationen entstanden und lassen Aussagen über den ethnischen und geographischen Ursprung eines Individuums zu.
Diversität in kodierenden und nichtkodierenden Bereichen
Die Mechanismen, die zu Unterschieden in der Variabilität unterschiedlicher chromosomaler Regionen beitragen, sind noch sehr unzureichend untersucht. Ein besseres Verständnis liegt für die Muster von Variabilität vor, welche man im Bereich von Genen beobachtet. Nicht unerwartet zeigt sich eine geringere Nukleotid-Diversität in Protein kodierenden Bereichen (Exons) im Vergleich zu nichtkodierenden Bereichen (Introns). Diese Beobachtung ist konsistent mit der Erwartung, dass auf der Variabilität in kodierenden Bereichen ein größerer negativer Selektionsdruck lastet. In den kodierenden Bereichen selbst sind nicht alle Basen gleichmäßig betroffen: So ist seit langem bekannt, dass der durch Basentripletts (Codons) definierte genetische Code degeneriert ist. Dies bedeutet, dass jeweils mehrere Tripletts eine Aminosäure kodieren, da die Anzahl möglicher Triplett-Kombinationen viel größer ist (A, C, G und T bilden 43 = 64 mögliche Tripletts) als für die Kodierung der 20 Protein bildenden Aminosäuren nötig wäre. Die erste und zweite Base in einem Codon kodieren häufig sehr spezifisch für eine Aminosäure (nichtdegenerierte Positionen); Mutationen an diesen Positionen bewirken dann einen Aminosäureaustausch im resultierenden Protein. An der dritten Position im Codon für eine bestimmte Aminosäure sind hingegen oft alle vier Basen möglich (degenerierte Positionen). Mutationen an diesen Stellen verändern die Aminosäuresequenz dann nicht. Wie aus den Untersuchungen zur Variabilität in kodierenden Sequenzen hervorgeht, beobachtet man an den nichtdegenerierten Positionen eine signifikant verminderte Nukleotid-Diversität im Vergleich zu den degenerierten Positionen. Offenbar führen Mutationen an nichtdegenerierten Stellen häufig zu einem Selektionsnachteil, weil das resultierende Protein durch die Änderung der Aminosäuresequenz seine normale Funktion ganz oder zum Teil verliert. Somit werden solche Mutationen oft wieder aus der Population selektiert. Dafür spricht auch die Beobachtung, dass die meisten Varianten an nichtdegenerierten Positionen geringe Allelfrequenzen haben (19). Dies deutet darauf hin, dass sie ihre Frequenz in der Bevölkerung nicht erhöhen können, da dem ein negativer Selektionsdruck entgegensteht.
Die Häufigkeit vieler krankheitsverursachender Mutationen in Genen scheint sich im Laufe der Zeit in einer Bevölkerung auf einen bestimmten Wert einzupendeln. Dies liegt daran, dass im gleichen Maße, wie diese Mutationen durch einen negativen Selektionsdruck ausgelesen werden, Neumutationen hinzukommen. Ein weiterer Mechanismus, der trotz negativem Selektionsdruck gegen die Erkrankten für eine konstante Frequenz der krankheitsverursachenden Mutation in der Bevölkerung sorgen kann, ist besonders für viele rezessiv erbliche Krankheiten bekannt. Während die homozygot Betroffenen einen starken Selektionsnachteil haben, können äußerlich gesunde, heterozygote Anlageträger durchaus einen Selektionsvorteil haben (wie zum Beispiel für die Sichelzellanämie und die Thalassämien).
Der Großteil der SNPs in nichtkodierenden Bereichen wird mit großer Wahrscheinlichkeit phänotypisch ohne Auswirkungen bleiben und evolutionär neutral sein. Zumindest für einen Teil der SNPs in den kodierenden Bereichen wird dies anders sein. Ein wichtiger Gegenstand der Forschung in den nächsten Jahren wird es sein herauszufinden, welche Varianten in kodierenden Bereichen phänotypische Konsequenzen haben und inwiefern sich das im Zusammenspiel mit anderen Varianten und unter bestimmten Umweltbedingungen günstig oder ungünstig auf den Träger auswirkt. Dies wird vor allem für das Verständnis von in der Bevölkerung häufigen Erkrankungen von enormer Wichtigkeit sein, da die Identifizierung dieser Varianten den Schlüssel zum Verständnis der beteiligten molekularen Prozesse liefert. Letzteres wird wiederum neue Möglichkeiten für Therapie und Prävention eröffnen.
In diesem Artikel wurden die im menschlichen Genom vorkommenden Varianten betrachtet. Darauf aufbauend ergibt sich aber noch eine weitere Ebene genetischer Variabilität dadurch, dass räumlich auf den Chromosomen nahe beieinander liegende Varianten nicht
unabhängig voneinander weitervererbt werden. Dies hat spezifische Auswirkungen für die Krankheitsforschung. In der nächsten Ausgabe des Deutschen Ärzteblatts wird daher die erst kürzlich entdeckte Blockstruktur des Genoms erläutert (7).
Manuskript eingereicht: 13. 8. 2002, angenommen: 28. 8. 2002
zZitierweise dieses Beitrags:
Dtsch Arztebl 2002; 99: A 3091–3101 [Heft 46]
Die Zahlen in Klammern beziehen sich auf das Literaturverzeichnis, das über den Sonderdruck beim Verfasser und über das Internet (
Deutsches Ärzteblatt: Homepage) erhältlich ist.
Anschrift für die Verfasser:
Dr. rer. nat. Sven Cichon
Department of Medical Genetics
Universität Antwerpen
Universiteitsplein 1, 2610 Antwerpen, Belgien
E-Mail:
[email protected]
Weitere Informationen im Internet:
dbSNP Home Page
www.ensembl.org/
Ansonsten; für Heather ; viel Glück am Montag für dein Telefonat mit der Humangenetikerin
Grüße vom Jens
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